Detection of Plasmodium in faeces of the New World primate Alouatta clamitans

Abstract Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax have evolved with host switches between non-human primates (NHPs) and humans. Studies on the infection dynamics of Plasmodium species in NHPs will improve our understanding of the evolution of these parasites; however, such studies are hampered by the difficulty of handling animals in the field. The aim of this study was to detect genomic DNA of Plasmodium species from the faeces of New World monkeys. Faecal samples from 23 Alouatta clamitans from the Centre for Biological Research of Indaial (Santa Catarina, Brazil) were collected. Extracted DNA from faecal samples was used for molecular diagnosis of malaria by nested polymerase chain reaction. One natural infection with Plasmodium simium was identified by amplification of DNA extracted from the faeces of A. clamitans. Extracted DNA from a captive NHP was also used for parasite genotyping. The detection limit of the technique was evaluated in vitro using an artificial mixture of cultured P. falciparum in NHP faeces and determined to be 6.5 parasites/µL. Faecal samples of New World primates can be used to detect malaria infections in field surveys and also to monitor the genetic variability of parasites and dynamics of infection.

Plasmodium simium/Plasmodium vivax infections in southern brown howler monkeys from the Atlantic Forest

Blood infection by the simian parasite, Plasmodium simium, was identified in captive (n = 45, 4.4%) and in wild Alouatta clamitans monkeys (n = 20, 35%) from the Atlantic Forest of southern Brazil. A single malaria infection was symptomatic and the monkey presented clinical and haematological alterations. A high frequency of Plasmodium vivax-specific antibodies was detected among these monkeys, with 87% of the monkeys testing positive against P. vivax antigens. These findings highlight the possibility of malaria as a zoonosis in the remaining Atlantic Forest and its impact on the epidemiology of the disease.

Submicroscopic malaria parasite carriage: how reproducible are polymerase chain reaction-based methods?

The polymerase chain reaction (PCR)-based methods for the diagnosis of malaria infection are expected to accurately identify submicroscopic parasite carriers. Although a significant number of PCR protocols have been described, few studies have addressed the performance of PCR amplification in cases of field samples with submicroscopic malaria infection. Here, the reproducibility of two well-established PCR protocols (nested-PCR and real-time PCR for the Plasmodium 18 small subunit rRNA gene) were evaluated in a panel of 34 blood field samples from individuals that are potential reservoirs of malaria infection, but were negative for malaria by optical microscopy. Regardless of the PCR protocol, a large variation between the PCR replicates was observed, leading to alternating positive and negative results in 38% (13 out of 34) of the samples. These findings were quite different from those obtained from the microscopy-positive patients or the unexposed individuals; the diagnosis of these individuals could be confirmed based on the high reproducibility and specificity of the PCR-based protocols. The limitation of PCR amplification was restricted to the field samples with very low levels of parasitaemia because titrations of the DNA templates were able to detect < 3 parasites/µL in the blood. In conclusion, conventional PCR protocols require careful interpretation in cases of submicroscopic malaria infection, as inconsistent and false-negative results can occur.

A infecção malárica pelo Plasmodium simium/Plasmodium vivax em primatas não humanos de três regiões da Mata Atlântica brasileira / Malaria infection caused by Plasmodium simium/Plasmodium vivax in non human primates from the brazilian Atlantic Forest

No Brasil, os casos de malária humana concentram-se na região amazônica.Entretanto, casos autóctones da doença têm sido relatados em diferentes regiões de Mata Atlântica. Sugere-se que a manutenção destes casos envolva a presença de macacos infectados. Nas regiões sul e sudeste do país circula o parasito de primatas Plasmodium simium, semelhante ao parasito de humanos P. vivax. No entanto, pouco se conhece sobre o parasito simiano e a sua proximidade morfológica, imunológica e genética com o P. vivax dificulta sua caracterização. Diante da necessidade de uma melhor compreensão da malária simiana, propôs-se neste trabalho realizar um levantamento da doença do ponto de vista clínico, molecular e imunológico em primatas de Mata Atlântica, dos estados Santa Catarina, Paraná e Mato Grosso do Sul. Em SC,foi observada uma taxa de infecção malárica pelo PCR de 35% em animais devida livre e 4% em animais de cativeiro...

Todos os animais do PR e MS foram negativos. Entretanto, em todos os estados foi identificado por meio do ELISA,uma reatividade de anticorpos contra as proteínas recombinantes PvDBPII,PvMSP-119 e PvAMA-1. Ainda, anticorpos presentes no soro de bugios foramcapazes de bloquear a interação PvDBP-DARC, com uma relação positiva entre a reatividade no ELISA e presença de anticorpos bloqueadores. Além disso, a interação específica PvDBP-DARC em amostras de bugios ruivos sugere que o parasito P. simium possui uma proteína ortóloga a PvDBP e dessa forma, compartilhe a mesma via de invasão que o P. vivax. A análise de microssatélites demonstrou alelos novos e exclusivos, trazendo perspectivas para a diferenciação das populações do parasito. Através da análise da diversidade genética das sequências obtidas de P. simium foi possível caracterizar polimorfismos conservados, sendo alguns deles nunca descritos em P. vivax. Contudo, apesar destes polimorfismos, a reconstrução da filogenia baseada nos genes DBP, MSP-1 e 18S não permitiu a separação das espécies, o que reforça a proximidade genética entre os parasitos e aponta para uma transferência de hospedeiros recente. Finalmente, a presença de símios infectados em áreas de Mata Atlântica sugere que os primatas possa matuar como reservatórios da doença, uma vez que casos humanos já foram descritos nas cidades estudadas...

A infecção malárica pelo Plasmodium simium/Plasmodium vivax em primatas não humanos de três regiões da Mata Atlântica brasileira

No Brasil, os casos de malária humana concentram-se na região amazônica.Entretanto, casos autóctones da doença têm sido relatados em diferentes regiões de Mata Atlântica. Sugere-se que a manutenção destes casos envolva a presença de macacos infectados. Nas regiões sul e sudeste do país circula o parasito de primatas Plasmodium simium, semelhante ao parasito de humanos P. vivax. No entanto, pouco se conhece sobre o parasito simiano e a sua proximidade morfológica, imunológica e genética com o P. vivax dificulta sua caracterização. Diante da necessidade de uma melhor compreensão da malária simiana, propôs-se neste trabalho realizar um levantamento da doença do ponto de vista clínico, molecular e imunológico em primatas de Mata Atlântica, dos estados Santa Catarina, Paraná e Mato Grosso do Sul. Em SC,foi observada uma taxa de infecção malárica pelo PCR de 35% em animais devida livre e 4% em animais de cativeiro.

Todos os animais do PR e MS foram negativos. Entretanto, em todos os estados foi identificado por meio do ELISA,uma reatividade de anticorpos contra as proteínas recombinantes PvDBPII,PvMSP-119 e PvAMA-1. Ainda, anticorpos presentes no soro de bugios foramcapazes de bloquear a interação PvDBP-DARC, com uma relação positiva entre a reatividade no ELISA e presença de anticorpos bloqueadores. Além disso, a interação específica PvDBP-DARC em amostras de bugios ruivos sugere que o parasito P. simium possui uma proteína ortóloga a PvDBP e dessa forma, compartilhe a mesma via de invasão que o P. vivax. A análise de microssatélites demonstrou alelos novos e exclusivos, trazendo perspectivas para a diferenciação das populações do parasito. Através da análise da diversidade genética das sequências obtidas de P. simium foi possível caracterizar polimorfismos conservados, sendo alguns deles nunca descritos em P. vivax. Contudo, apesar destes polimorfismos, a reconstrução da filogenia baseada nos genes DBP, MSP-1 e 18S não permitiu a separação das espécies, o que reforça a proximidade genética entre os parasitos e aponta para uma transferência de hospedeiros recente. Finalmente, a presença de símios infectados em áreas de Mata Atlântica sugere que os primatas possa matuar como reservatórios da doença, uma vez que casos humanos já foram descritos nas cidades estudadas.

A reação em Cadeia da Polimerase como técnica auxiliar no diagnósitco de malária em serviços de saúde de referencia em Minas Gerais

O diagnóstico de rotina para malária humana continua sendo um desafio para os laboratórios dos países onde a doença é endêmica. Nestas áreas, o diagnóstico de rotina continua sendo a microscopia óptica (MO), que apesar de sua relativa simplicidade e baixo custo, depende de um microscopista bem treinado. Diante desta limitação, a partir da década de 90, muitos protocolos baseados na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) têm sido publicados, o que tem permitido a identificação e caracterização das espécies de plasmódios. O grande impacto da PCR tem sido, principalmente, em estudos epidemiológicos, pela possibilidade de detectar parasitas abaixo do limite de detecção da MO. Entretanto, poucos estudos têm validado a PCR em laboratórios de referência de países endêmicos, onde os microscopistas são capazes de detectar parasitemias tão baixas quanto 5 parasitas/μL de sangue. Diante disso, propôs-se, no presente trabalho, avaliar a técnica de PCR como ferramenta auxiliar no diagnóstico de malária em Serviços de Saúde de referência para o diagnóstico laboratorial de malária em Minas Gerais. Inicialmente, o desempenho de duas técnicas moleculares, a Nested-PCR e a PCR em Tempo Real, foi avaliado em 94 amostras de campo. Os resultados permitiram concluir que não houve diferença estatisticamente significativa entre a Nested-PCR e a PCR em Tempo Real. Além disso, para simplificar a coleta das amostras, foram comparadas extrações a partir de sangue total e sangue em papel de filtro, com volumes de 30 e 60μL de sangue em papel (n=70). Não houve diferença entre a PCR realizada com amostras de sangue total ou em papel de filtro. De relevância, todos os protocolos de PCR apresentaram limitações para detectar parasitemias abaixo de 100 parasitas/μL de sangue. Estes resultados, embora aparentemente contraditórios com a literatura, estão de acordo com os poucos estudos que avaliaram em amostras de campo a sensibilidade da PCR em função da densidade parasitária.

De fato, em diversos protocolos a detecção da PCR é de 300 parasitas/μL de sangue). Para a maior parte dos indivíduos que retornaram aos serviços para verificação da cura parasitológica (11/13), a PCR concordou com a MO, sendo que em dois deles, a PCR permaneceu positiva enquanto a MO já havia negativado. Pode-se concluir que a PCR tem limitações para detecção de baixas parasitemias e recomenda-se cautela ao se estabelecer a PCR como ferramenta diagnóstica, já que a amplificação do DNA pode não significar doença clínica.

A reação em Cadeia da Polimerase como técnica auxiliar no diagnósitco de malária em serviços de saúde de referencia em Minas Gerais / The polymerase chain reaction technique to assist in diagnostic malaria in health services reference in Minas Gerais

O diagnóstico de rotina para malária humana continua sendo um desafio para os laboratórios dos países onde a doença é endêmica. Nestas áreas, o diagnóstico de rotina continua sendo a microscopia óptica (MO), que apesar de sua relativa simplicidade e baixo custo, depende de um microscopista bem treinado. Diante desta limitação, a partir da década de 90, muitos protocolos baseados na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) têm sido publicados, o que tem permitido a identificação e caracterização das espécies de plasmódios. O grande impacto da PCR tem sido, principalmente, em estudos epidemiológicos, pela possibilidade de detectar parasitas abaixo do limite de detecção da MO. Entretanto, poucos estudos têm validado a PCR em laboratórios de referência de países endêmicos, onde os microscopistas são capazes de detectar parasitemias tão baixas quanto 5 parasitas/μL de sangue. Diante disso, propôs-se, no presente trabalho, avaliar a técnica de PCR como ferramenta auxiliar no diagnóstico de malária em Serviços de Saúde de referência para o diagnóstico laboratorial de malária em Minas Gerais. Inicialmente, o desempenho de duas técnicas moleculares, a Nested-PCR e a PCR em Tempo Real, foi avaliado em 94 amostras de campo. Os resultados permitiram concluir que não houve diferença estatisticamente significativa entre a Nested-PCR e a PCR em Tempo Real. Além disso, para simplificar a coleta das amostras, foram comparadas extrações a partir de sangue total e sangue em papel de filtro, com volumes de 30 e 60μL de sangue em papel (n=70). Não houve diferença entre a PCR realizada com amostras de sangue total ou em papel de filtro. De relevância, todos os protocolos de PCR apresentaram limitações para detectar parasitemias abaixo de 100 parasitas/μL de sangue. Estes resultados, embora aparentemente contraditórios com a literatura, estão de acordo com os poucos estudos que avaliaram em amostras de campo a sensibilidade da PCR em função da densidade parasitária.

De fato, em diversos protocolos a detecção da PCR é de <1 parasita/ μL de sangue, porém tal detecção tem sido baseada em amostras de DNA obtidas a partir de parasitos em cultura ou DNA plasmidial. Apesar destas limitações, em uma próxima etapa, optou-se por avaliar a técnica de PCR nos serviços de saúde dos municípios de Belo Horizonte e Uberlândia, no período de fevereiro a novembro de 2009. Neste período, 70 indivíduos com suspeita de infecção malárica procuraram os serviços, sendo 22 deles diagnosticados como positivos pela microscopia óptica. Em todos os indivíduos, positivos e negativos, os resultados da PCR concordaram com a MO, inclusive em relação à espécie de plasmódio. Neste grupo, as baixas parasitemias não foram freqüentes já que os pacientes que procuraram o serviço apresentavam altas parasitemias (>300 parasitas/μL de sangue). Para a maior parte dos indivíduos que retornaram aos serviços para verificação da cura parasitológica (11/13), a PCR concordou com a MO, sendo que em dois deles, a PCR permaneceu positiva enquanto a MO já havia negativado. Pode-se concluir que a PCR tem limitações para detecção de baixas parasitemias e recomenda-se cautela ao se estabelecer a PCR como ferramenta diagnóstica, já que a amplificação do DNA pode não significar doença clínica.

Leishmaniose visceral: estudo de flebotomíneos e infecção canina em Montes Claros, Minas Gerais / Visceral leishmaniasis: a study on phlebotomine sand flies and canine infection in Montes Claros, State of Minas Gerais

A leishmaniose visceral no Brasil estava inicialmente associada a áreas rurais, mas devido às diversas alterações no ambiente como, desmatamentos, urbanização e intenso processo migratório, ocorreu a expansão das áreas endêmicas, levando à urbanização da doença, principalmente nas regiões Sudeste e Centro Oeste do país. No município de Montes Claros, situado ao norte de Minas Gerais, foi feito um estudo para verificação da situação da LV. No ano de 2002 foi realizado inquérito sorológico canino e no período de setembro de 2002 a agosto de 2003 foi feito levantamento entomológico, utilizando armadilhas luminosas de CDC. A prevalência da LV canina apresentou taxa média de infecção em torno de 5 por cento. A fauna de flebotomíneos estimada foi de 16 espécies, totalizando 1043 exemplares. Lutzomyia longipalpis foi a espécie predominante com 74 por cento, o que sugere a sua participação na transmissão de LV em Montes Claros.